[求助] Real time RT PCR代工費用

cheanpen

我們實驗室主要是做材料的,RT PCR沒有人做過.
由於有時間上的壓力(培養一個樣本就要2個禮拜的時間),實驗室沒有時間讓我從錯誤中學習(因為已經失敗過一次了).

所以,老闆請我把樣本細胞培養好後,後面的部分請人家代工,之後暑假我再來慢慢練.

我們找到的生技公司在台北,報價對我們來說也可以接受.對方請我們把細胞用TRIZOL處理好,冷凍送過去.轉cDNA一個sample 900元,進行Real time RT PCR一個sample,一個基因作三次800元.不用自備kit,但是primer要自己買.

但,問題是,我老闆深深懷疑我到底有沒有能力確保"把細胞用TRIZOL處理好,冷凍送過去"這個步驟不會出現問題.因為我第一次的失敗,是RNA分解掉了,不知道錯誤發生在哪.

基於上述理由,我們又找到了別的所的實驗室幫忙.能力上應該沒問題.但,我們不知道如何和對方談費用問題.(因為對方也沒幫忙過別人,他們也不知道如何計價)

我們覺得 Real time RT PCR很難,所以,酬勞給多一點沒問題.但我們不知道一般實驗室是不是也覺得很難.如果大家都認為這沒什麼,而我們卻給了意外高的酬勞,嗯..我們也覺得這樣似乎不是很好.

另外,之前提到,給生技公司代工,不用自備kit.但,我們不前仍然不太清楚我們委託的實驗室,他們需不需要我們自備轉cDNA的kit和跑PCR的kit.所以,kit是我們自己買(很貴2~3萬元),或是對方提供.費用上似乎又是一個考慮的因素.

我最近深深為此所困擾,不知道各位有操作過的朋友,認為如何計費是比較合理的呢??

cheanpen

這裡我再問一個問題:

生技公司希望我把細胞用tripsin打下來,算好5*10^5個細胞,放到離心管裡,離心.
接著,把上清液倒乾,再添加1.0ml的trizol.然後,栓好蓋子,放到-80度的冰箱內保存.
再請冷凍宅配把樣本送給他們.

這裡我的疑問是--
"5*10^5個細胞,放到離心管裡,離心,接著,把上清液倒乾",這麼少的細胞,離心後,看的到pellet沉在底部嗎??會不會我一倒就倒光光了??

我在樣本內添加trizol之後,放置在-80度的冰箱內,之後請宅配送到台北.如果都有保持至少-20度的低溫,那麼這中間是否還是有發生分解的可能??


唉...
我快緊張死了.

bioer

針對第二個
只要能沉降在離心管, 並黏住..並不會因為你的量比較少就被倒掉了

alpe0924

祈禱吧~~~
  RNase太耐命了... ... 又難清 ...  ... 而已很容易污染
會失敗不是沒可能的,應該說很正常吧!
溫度倒不是很大的問題,只要沒清除RNase,或不小心讓它進去sample


就只能收屍... ...

shadowwall

RTPCR並不會難，只是需要經驗
我想對方若就是生化實驗室的話可以不用給的太高啦！最好的方法就是把生技公司的價錢打個朋友的折數來算，Kit他們有的話應該是不拿給他們啦!但primer還是要你們先買好給他們吧~

若你RNA被解掉，可能原因還真的不少，當然RNase是挺討厭的一個沒錯，這種實驗經驗的部份去別的實驗室問一問該加什麼以解決管中的干擾物會比較快。

-20度C不能說完全就都安全，若你sample裡不夠乾淨，等對方拿到開始做後續動作時，還是會被解掉的

另外問一下，你們是做晶片的?

cheanpen

Originally posted by shadowwall at 2005-6-2 08:08 PM:
RTPCR並不會難，只是需要經驗
我想對方若就是生化實驗室的話可以不用給的太高啦！最好的方法就是把生技公司的價錢打個朋友的折數來算，Kit他們有的話應該是不拿給他們啦!但primer還是要你們先買好給他們吧~

請問一下,kit有分生物種類的嗎??我知道primer有,但我不曉得轉cDNA和之後跑PCR的kit有沒有物種限定.

Originally posted by shadowwall at 2005-6-2 08:08 PM:

另外問一下，你們是做晶片的?

我們是做植體表面處理的.

chiuj

<p>

這裡我的疑問是-- &quot;5*10^5個細胞,放到離心管裡,離心,接著,把上清液倒乾&quot;,這麼少的細胞,離心後,看的到pellet沉在底部嗎??會不會我一倒就倒光光了??

將在15ml conical tube的cell suspension以1200rpm, 4C, 離心10min後將蓋子打開，反轉tube&quot;直接&quot;(免驚)把medium倒掉; 殘留的液體在無菌紗布上tab吸乾 (這個動作我每天都在做，100%確定沒有問題。) 如果真的擔心B)，借一個suction，將tube微傾斜(不必up-side down)，用pasteur pipet將medium吸出即可 另外，是&quot;trypsin&quot;

我在樣本內添加trizol之後,放置在-80度的冰箱內,之後請宅配送到台北.如果都有保持至少-20度的低溫,那麼這中間是否還是有發生分解的可能??

請愛用&quot;乾冰&quot; 將sample用保麗龍盒裝乾冰，封好後寄送；寄到美國都沒有問題（常降子搞 ）<strike>Real time RT不是太困難的技術，在mol-bio lab算是「國民基本須知」。</strike></p><p>建議可以給生物科技公司做（哪一家可以透露一下嗎？）給實驗室做，如果必須考慮人工成本肯定不划算；欠人情，也有可能要paper掛名(雖然只做一個技術也掛名, 這樣有點扯) 。</p>

[ Last edited by chiuj on 2005-6-3 at 12:28 ]

shadowwall

Originally posted by cheanpen at 2005-6-2 10:08 PM:


請問一下,kit有分生物種類的嗎??我知道primer有,但我不曉得轉cDNA和之後跑PCR的kit有沒有物種限定.

kit沒分生物種類

shadowwall

有個疑問耶....
trypsin可以把cell分出來???不是只用來切peptide嗎?

cheanpen

Originally posted by shadowwall at 2005-6-2 11:53 PM:
有個疑問耶....
trypsin可以把cell分出來???不是只用來切peptide嗎?

沒錯呀!翻一翻細胞培養的書,書上都會講吧?!

chiuj

Originally posted by shadowwall at 2005-6-2 11:53 PM:
有個疑問耶....
trypsin可以把cell分出來???不是只用來切peptide嗎?

正確的說法（成分）應該是「trypsin-EDTA」

chiuj

Originally posted by shadowwall at 2005-6-2 08:08 PM:
RTPCR並不會難，只是需要經驗

RT並不會難--->國民基本須知
Realtime PCR--->如果說SYBR green是ipaq2210; ABI Tagman系統就是6365

若你RNA被解掉，可能原因還真的不少，當然RNase是挺討厭的一個沒錯，這種實驗經驗的部份去別的實驗室問一問該加什麼以解決管中的干擾物會比較快。-20度C不能說完全就都安全，若你sample裡不夠乾淨，等對方拿到開始做後續動作時，還是會被解掉的

通常是水被RNase污染；真的擔心Invitrogen Gibco有RNase free water可購買。
真的怕環境污染，找一台laminar flow操作台操作RNA，已避免飛來的禮物污染。

如果想要保存已抽出的RNA，可以將RNA儲存在"EtOH-Ammonium  
Acetate"@ -20C rather than pure water or TE. 這樣就非常安全了